3-1. 기기, 재료 및 Stock solution– WSE-7310 EzGel Ace, WSE-7150 EzGel Sep, WSE-7155 EzGel Stack,
etc. (Gel buffer) < Stock solution 제작 >
(B) Gel buffer
* Gel buffer는 WSE-7310 EzGel Ace 단독으로 사용하거나, WSE-7155 EzGel Stack, WSE-7150 EzGel Sep의 조합으로 사용해주십시오. (C) 10% APS (Ammonium persulfate) (D) TEMED (N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine) 주요 전기영동 시약의 조성 3-2. Plate 조립 (AE-6401 1 mm Dual Mini Gel Cast)ATTO의 AE-6401 1 mm Dual Mini Gel Cast를 이용하여 gel을 제작하는 방법을 소개합니다. ATTO의 WSE-1190 Multi Mini-Slab Gel Cast를 이용하여 gel을 제작하는 방법을 소개합니다. 전기영동은 단백질 고유의 전하나 분자량의 차이를 이용하여 전기로 각 분자를 분리하는 방법입니다. 가장 많이 사용되는 SDS-PAGE는 단백질에 SDS를 부가하여 음극으로 대전시키고 acrylamide gel의 mesh구조를 이용하여 단백질 분자량의 차이로 분리합니다. ATTO의 제품을 사용하여 SDS-PAGE의 기본 조작에 대해 소개하겠습니다. 1. 샘플 제작 2. Gel 제작 3. 전기영동 4. Gel staining 3. 기기 · 시약 · 재료
< Gel을 제작하는 경우 >
4. 실험 방법4-1. 샘플의 조제< 통상적인 전기영동 샘플 > * 제작한 샘플은 -20℃에서 보존 가능합니다. < 형광 라벨 전기영동 샘플 > 참고: 자세한 내용은 “Method for extracting protein from tissue or cell“, “Sample preparation for electrophoresis“를 참조하십시오. 4-2. Gel의 제작
2. Gel 용액을 제작합니다. Gel 조성표 (아래 표)에 따라 Separating gel과 Stacking gel의 gel 용액을 제작합니다.
* 위 표는 Mini-gel size 1장에 필요한 용량입니다. 3. Separating gel 용액에 APS와 TEMED를 첨가하여 거품이 나지 않도록 혼합한 후 gel plate에 separating gel 용액을 흘려 넣습니다. 4. 경계면이 흐트러지지 않도록 주의하면서 증류수를 중층합니다. (0.2~1.0 mL) 5. 실온에서 30분 이상 정치하여 중합합니다. 6. 중층된 증류수를 filter paper 등으로 흡수하여 완전히 제거합니다. 7. Stacking gel 용액에 APS와 TEMED를 첨가하여 거품이 나지 않도록 혼합한 후 separating gel 위에 stacking gel 용액을 중층합니다. 8. Comb을 꽂고 실온에서 30분 이상 정치하여 중합합니다. 4-3. 전기영동1. 전기영동장치 하부조에 충분한 양의 running buffer를 넣습니다. 2. 제작한 gel 또는 precast gel (e-PAGEL 등)을 gel 하단에 공기가 들어가지 않도록 주의하여 전기영동장치에 세팅합니다. 3. 상부조에 충분한 양의 running buffer를 넣습니다. 4. Well에 샘플을 loading합니다. (5~10 μL/lane) 5. 시작 버튼을 눌러 전기영동을 시작합니다. 4-4. Gel staining1. AE-1340 EzStain AQua를 gel보다 약간 큰 tray에 넣습니다. (30~50 mL/gel) 2. 전기영동 직후의 gel을 EzStain AQua에 담그고 실온에서 3시간~overnight 동안 shaking하면서 staining합니다. 3. 단백질 밴드가 충분히 staining되었음을 확인한 후 EzStain AQua를 폐기하고 증류수로 gel을 가볍게 헹굽니다. 충분한 양의 증류수를 가하여 탈색합니다. 중간중간 증류수를 새로 교체하고, background가 투명해질 때까지
탈색합니다. 5. 참고 결과실험예1. Staining 방법의 차이위의 사진은 Transferrin protein을 AE-1430 EzApply 또는 WSE-7010 EzLabel FluoroNeo를 사용하여 전기영동 샘플을 제작한 후에 c-PAGEL을 사용하여 400 ng부터 1/2 dilution factor로 loading하여 전기영동한 결과입니다. 전기영동 후 gel은 EzStain AQua, 직접 제조한 CBB staining solution 및 EzStain Silver로 staining하였습니다. EzLabel FluoroNeo 샘플은 전기영동 후 gel을 CyanoView로 excitation하고 540 nm LP filter를 이용하여 0.5초간 exposure하여 LuminoGraph로 촬영한 결과입니다. 직접 제작한 CBB staining solution보다 EzStain AQua는 검출 감도가 높으며, EzLabel FluoroNeo는 silver staining과 동등 이상의 검출 감도를 보였습니다. EzLabel FluoroNeo는 staining에 소요되는 시간이 필요없으며, 촬영 후 gel은 western blotting 등의 실험에도 사용할 수 있어 단시간에 효율적인 실험이 가능합니다. 한편, staining한 후의 gel은 western blotting 실험에 적합하지 않습니다. Staining 방법은 실험 목적이나 검출 감도에 맞게 선택하여 주십시오. 실험예2. Running buffer의 차이위 사진은 다양한 단백질을 동일한 acylamide 농도의 10% e-PAGEL HR을 이용하여 running buffer가 다른 조건, AE-1410 EzRun (왼쪽)과 WSE-7065 EzRun MOPS (오른쪽)에서 전기영동한 결과입니다. 빨간색 사각형 부분은 양쪽 모두 molecular weight marker인 AE-1440 EzStandard를 전기영동한 lane입니다. EzRun에서는 4개의 밴드가 검출된 반면, EzRun MOPS에서는 6개의 밴드가 검출되고 있어서 저분자 단백질도 분리가 용이합니다. 즉, running buffer를 EzRun MOPS로 변경하는 것만으로 10% 농도의 gel이 gradient gel과 유사한 밴드 패턴을 보이게 됩니다. 이처럼 running buffer를 교체함으로 동일한 acrylamide 농도의 gel을 사용하더라도 단백질의 분리 범위를 바꿀 수 있습니다. Related ProductsWSE-1165 Mini-Slab 고속
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